通过微调底物结合口袋实现环氧化物水解酶的区域选择性转换，以合成(R)-和(S)-苯基-1,2-乙二醇
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分类：行业动态

发布时间：2024-12-10 13:04
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【概要描述】环氧化物水解酶（Epoxide hydrolase, EHs, EC3.3.2.-）普遍存在于各种生命形式中，能特异性地水解外消旋环氧底物，并生成相应的手性1,2-二醇。

通过微调底物结合口袋实现环氧化物水解酶的区域选择性转换，以合成(R)-和(S)-苯基-1,2-乙二醇
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环氧化物水解酶（Epoxide hydrolase, EHs, EC3.3.2.-）普遍存在于各种生命形式中，能特异性地水解外消旋环氧底物，并生成相应的手性1,2-二醇（如图1）。手性环氧化物和1,2-二醇是合成高价值药物的关键中间体，例如，(R)-苯基-1,2-乙二醇（(R)-PED）是合成芳基烷基胺钙化剂(R)-(+)-NPS R-568的前体，(S)-PED可用于生产KDMSO抑制剂。然而，天然EHs对环氧化物底物的两种对映体的区域选择性普遍较差，且EHs的分子修饰能够达到完全逆转其区域选择性的案例较少。

图1. EHs对外消旋环氧化物的水解作用

因此，本文通过计算机辅助设计，对来自Rhodotorula paludigena JNU001的环氧化物水解酶(RpEH)的底物结合袋(SBP)内特定残基进行靶向突变。并研究了RpEH突变体催化苯乙烯氧化物（SO）进行区域选择性水解的工业应用。此外，作者通过分子动力学（MD）模拟，初步解释了RpEH-I194F对(S)-SO的区域选择性逆转的机制。

具体的研究过程如下：

①RpEH对外消旋环氧化物(rac-SO)的区域选择性水解作用

利用RpEH的湿细胞催化rac-SO进行水解反应，可生成(R)-苯基-1,2-乙二醇，转化率为93.6%，说明该酶对R构型产物有立体选择性，产物ee值为67.8%。同时测定了(S)-和(R)-SO的区域选择性系数α_S和β_R值（计算公式如下[1]）。结果表明，RpEH具有较高的β_R值（90.8%），对(S)-SO区域选择性系数α_S值（77.0%）较低。

区域选择性系数计算公式：

(S)-SO的区域选择性系数用α_S和β_S表示，α_S=[R_p/(R_p+S_p)]×100%，α_S+β_S=100%；

(R)-SO的区域选择性系数用α_R和β_R表示，α_R=[S_p/(R_p+S_p)]×100%，α_R+β_R=100%；

其中，R_p和S_p分别表示R型产物和S型产物的浓度。

②RpEH突变体的设计、构建及筛选

在本文中，将RpEH与底物(S)-SO对接，通过MD模拟获得1000个对接构像，从中分析RpEH的SBP区域残基和(S)-SO之间的相互作用频率，频率超过50%的候选突变残基有Tyr331、Pro216、Ile194和Leu360。由于Tyr331是催化活性中心残基，Pro216的刚性环状结构对维持β-转角稳定性有重要作用，因此最终选择Ile194和Leu360进行定点突变。

将194和360位点的残基分别替换为Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Asn、Val、Trp和Tyr，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，而后将重组菌体进行培养、诱导表达。通过RpEH野生型(WT)及突变体酶对rac-SO底物的水解反应，最终筛选到了2个较优突变体RpEH-L360V和RpEH-L360F，比WT的水解活性分别提高了102%和114.4%（如图2）。

图2. RpEH野生型(WT)及突变体酶的水解活性

③RpEH突变体区域选择性的研究

为了探究RpEH突变体对rac-SO的区域选择性，在25℃下，利用RpEH突变体湿细胞对rac-SO进行12h水解，并测定了它们的区域选择系数（α_S和β_R）。结果显示，RpEH-L360V对底物rac-SO的转化率高（c>99%），产物(R)-PED的eep值高达84.6%。值得关注的是，RpEH-I194F对rac-SO的水解生成了相反构型的产物(S)-PED（如表1，仅列出比WT活性高的突变体数据）。

表1. RpEH野生型(WT)及其突变体对rac-SO的转化率、

ee值和区域选择性系数

（表格中带负号的ee_p值表示生成的产物为S构型）

④突变体RpEH-I194F的区域选择性逆转机理

根据“近攻构象异构体（NAC）”理论， Asp的亲核O原子与环氧化物的亲电C_α或C_β之间的距离（dα或dβ）对于确定EH区域选择性至关重要。因此，本文将底物(S)-SO对接到RpEH和RpEH-I194F的SBPs中，形成两种不同的EH-环氧化物复合物，再通过MD模拟了底物与SBP残基分子间相互作用时的构象变化。

结果表明，EH-环氧化物复合物RpEH-I194F-(S)-SO的平均dα值大于RpEH-(S)-SO，而dβ值小于RpEH-(S)-SO（如图3），说明RpEH中的Asp190亲核残基优先攻击(S)-SO的Cα，而RpEH-I194F则优先攻击C_β。

图3. RpEH（左）和RpEH-I194F（右）

分别与底物(S)-SO对接的复合物构象

RpEH-I194F攻击原子的改变是因为在RpEH-I194F-(S)-SO中，Ile194被Phe取代，改变了邻近Trp191的构象，增加了其与(S)-SO的Pi-Pi相互作用的频率，这些频繁的分子间相互作用引起了(S)-SO的构象变化，使其Cβ原子更靠近亲核Asp190（如图4），从而逆转RpEH-I194F的区域选择性。

图4. RpEH和RpEH-I194F与(S)-SO的

分子间相互作用力及底物构象变化

⑤突变体RpEH-L360V和RpEH-I194F的应用实例

由于突变体RpEH-L360V具有较高的α_S值（96.9%），而RpEH-I194F具有较高的β_S值（98.8%），且均具有较高的催化活性，因此将这两个突变体分别应用于底物(S)-1a的区域选择性水解反应，以合成手性苯基-1,2-乙二醇（(R)-1b和(S)-1b），具体反应路线如图5。

图5. RpEH-L360V和RpEH-I194F对

(S)-环氧化物1a水解的反应路线

同时，对突变体RpEH-L360V和RpEH-I194F的放大规模生产条件进行优化，最终得到的最佳反应条件如表2。RpEH突变体对底物的转化率均达99%以上，获得的产物ee值分别为97.2%和97.6%。

表2.RpEH-L360V和RpEH-I194F的最佳反应条件及结果

本文总结：本文通过对环氧化物水解酶(RpEH)的定点突变以调节突变体的区域选择性，最终筛选得到2个突变体RpEH-L360V和RpEH-I194F，他们的催化活性高，且具有不同的区域选择性。将RpEH-L360V和RpEH-I194F分别应用于(R)-和(S)-苯基-1,2-乙二醇的克级合成，均获得了大于99%转化率。此外，本文还通过MD模拟初步分析了突变体RpEH-I194F区域选择性逆转的机制。